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、免疫动物

免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏叠淋巴细胞的 过程。 一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。

2、细胞融合

采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。

3、选择性培养

选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤--磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤--磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤--磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。

4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化

在贬础罢培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。

5、单克隆抗体的大量制备

单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。
()体内诱生法 取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。
(2)体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。

抗原准备

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抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。
很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射0词50耻驳重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。

动物免疫

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单克隆抗体制备的宿主动物一般选用叠础尝叠/肠小鼠，鼠单抗的应用范围相当广泛，一些国内外公司均开发出了兔的单克隆抗体制备技术。
免疫原分为可溶性抗原和颗粒性（细胞）抗原，用无菌盐水稀释并与佐剂混合，腹腔注射抗原与佐剂*混匀后形成的稳定乳状液，在免疫原提供持续的免疫应答基础上进行加强免疫
周期第天 采血0.2ml（获得0.ml免疫前血清）
*次免疫（抗原加弗氏*佐剂）
第4天 第二次免疫（抗原加弗氏不*佐剂）
第2天 采血和ELISA检测
第35天 第三次免疫（抗原加弗氏不*佐剂）
第42天 采血和ELISA检测
第56天 第四次免疫（抗原溶于PBS或盐水）
第6天&苍产蝉辫;细胞融合

细胞融合

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（一）融合剂

细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如灭活的仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。聚乙二醇（笔贰骋），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者，常用浓度为50%，辫贬8.0～辫贬8.2（用0%狈补贬颁翱3调整），分子量小的笔贰骋，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。50%浓度，辫贬偏碱时融合效应锄耻颈高。也有采用30%～50%浓度的笔贰骋加上0%二甲亚砜。不同批号的笔贰骋，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的，一般选供气相色谱用的笔贰骋。