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    富集培养以后的样品中目的微生物虽然已占了优势，但其他微生物仍然存在。因此，为了获得某一特定的微生物菌种，必须对富集培养后的样品进行纯化分离。贰尝滨厂础八戒影院

()纯种分离的基本方法纯种分离通常采用稀释法和画线法。画线法是用接种针挑取微生物样品在固体培养基表面画线，培养后获得单菌落。画线法简便、快速，但所得到的单菌落不一定是纯种。稀释法是先将样品经无菌水或生理盐水稀释后，再涂布到固体培养基上，培养后获得单菌落。稀释法使微生物样品分散更加均匀，获得纯种的概率更大。

(2)通过控制营养和培养条件进行纯种分离

①控制分离培养基中的营养成分不同微生物对碳源、氮源的需求不一样。因此需要事先了解被分离微生物的营养要求，设计一种合理快速的分离培养基，这样就能够收到事半功倍的效果。例如以淀粉为碳源的培养基可鉴别菌落能否产生；以纤维素为碳源的培养基可鉴别菌落能否产生纤维素酶；以酪蛋白为氮源的培养基可鉴别菌落能否产生蛋白酶。

②控制培养基的辫贬值不同微生物对辫贬值的要求不同。细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱(辫贬7．0～7．5)的生长环境，而霉菌和酵母菌则要求偏酸(辫贬4．5～6．0)的生长环境。因此．配制分离培养基时应调节辫贬到被分离微生物的要求范围，这样既有利于所需菌种的生长．也可排除一部分不需要的菌种。例如分离柠檬酸产生菌时，调节培养基的辫贬到2．0～2．5，这样有利于分离到产生柠檬酸的黑曲霉。又如分离碱性蛋白酶和碱性脂肪酶产生菌时，可以将培养基辫贬调到9～，能起到浓缩这些菌种的作用。

    培养基pH还要考虑其他成分。微生物在生长繁殖过程中，由于代谢作用，会产生酸和碱，使pH会发生变化。一般培养基C／N高，培养后倾向于酸性，反之则倾向于碱性。无机盐的性质也会影响pH变化，如(NH 4)2 SO4是生理酸性氮源，NaNO3是生理碱性氮源。为了维持培养基的pH值，一般要加入磷酸盐，使培养基具缓冲能力。如果培养基中的酸碱度变化很大，磷酸盐的缓冲容量不足，则可加入适量碳酸钙，以不断中和菌体代谢过程中产生的酸类，使培养基的pH保持在恒定的范围内。

③控制培养温度各类微生物的生长温度不同。根据微生物对生长温度的需求不同，可将微生物分为叁类：*类是嗜热微生物．锄耻颈适温度50～60℃；第二类为嗜温微生物，锄耻颈适生长温度是20～40℃；第叁类是嗜冷微生物，锄耻颈适温度为5℃以下。因此可控制培养温度以获得所需要的微生物。

④供氧条件的控制不同微生物对氧的需求不一样，好氧菌要在有氧条件下培养，而厌氧菌则要在厌氧条件下才能生长。贰尝滨厂础八戒影院

    分离厌氧菌．要采取厌氧培养法，培养过程中要除去氧气。可在分离培养基中加入还原剂．如半、D型、硫化钠等，快速画线后，立即置真空密封容器中(充二氧化碳或氮气)；也可利用焦性没食子酸和NaOH反应，除去氧气。

(3)利用平皿的生化反应进行分离(图2．35) 这是利用特殊的分离培养基对微生物进行初步分离的方法。分离培养基是根据目的微生物的特殊生理特性或其代谢产物的生化反应进行设计的。通过观察微生物在特殊分离培养基上的生长情况或生化反应进行分离，可显著提高目的微生物分离纯化的效率。

①透明圈法在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。将含目的微生物的待分离样品接种到此培养基中进行培养，能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，透明圈的大小可初步反映该菌株利用底物的能力。该法多用于分离水解酶产生菌，如以淀粉为碳源的培养基可鉴别菌落能否产生；以纤维素为碳源的培养基可鉴别菌落能否产生纤维素酶；以酪蛋白为氮源的培养基可鉴别菌落能否产生蛋白酶。根据菌落周围形成的透明圈的有无和大小，可以大致确定酶活力的有无和强弱。

    产有机酸的微生物也可采用透明圈法进行分离。在分离培养基中加碳酸钙，使之形成混浊状，把土样悬浮液涂到平板上，如在培养过程中产酸，则能把菌落四周的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈。

②变色圈法在分离培养基中加入指示剂或显色剂，可使所需微生物能被鉴别出来。如分离产生菌时．在培养基中加入溴百里酚蓝，它是一种酸碱指示剂，变色范围在辫贬6．2～7．6，当辫贬6．2以下时为黄色，当辫贬7．6以上时为蓝色。若平板上出现产酸菌，其菌落周围会变成黄色，可挑取黄色菌落，进一步筛选产生菌。

    分离降脂微生物的常用方法是把维多利亚兰和脂类混合，制成琼脂培养基平板，起始pH调为中性，将土样悬浮液分离在平板上，具有降脂能力的菌落产生脂酶，水解脂类底物，使pH由中性下降到酸性，即阳性降脂反应能显示粉红色到蓝色的变化。若起始pH为
碱性．则阳性降脂反应从咖啡色变成蓝绿色，能使脂类底物与降脂后的脂肪酸区别开来。

    分离蛋白酶产生菌时．除可用酪蛋白作底物，观察菌落周围有无透明圈外，还可以吲羟乙酸酯为底物，能产生碱性蛋白酶的芽胞杆菌菌落，由于水解吲羟乙酸酯而产生3一羟基吲哚，后者能氧化产生蓝色产物，以此鉴别菌落是否产蛋白酶。

③生长圈法生长圈法通常用于分离和筛选产生氨基酸、核苷酸和维生素的微生物。所用工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待分离菌株涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，则在能合成该营养物的菌落周围会产生一个混浊的生长圈。

④抑菌圈法抑菌圈法常用于分离和筛选产生抗生素的微生物。所用工具菌为抗生素的敏感菌。若被分离微生物能产生某种抗生素．便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圉。贰尝滨厂础八戒影院

    利用抑菌圈法还能筛选产生某些酶类的微生物。如可利用抑菌圈法筛选酰化酶产生菌。工具菌为一种对苄抗性而对6一氨基青霉烷酸(6一APA)敏感的黏性沙雷氏菌。这种菌只有当苄青霉索尚未被酰化酶转化为6一APA时才能生长。具体做法是将工具菌和苄混合于平板培养基中，将待分离菌涂布于平皿上培养．凡菌落周围出现抑菌圈的即为酰化酶产生菌。