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()原生质体融合的影响因素

①融合剂 融合剂有化学融合剂和物理融合剂。

    现在普遍采用的化学融合手段是聚乙二醇(PEG)介导的化学融合法。PEG以分子桥的形式在相邻原生质体膜间起中介作用．改变原生质膜的流动性能，降低原生质膜表面势能，使膜中的蛋白颗粒凝集，形成一层易于融合的无蛋白质颗粒的磷脂双分子层。在Ca 2+存在下，引起细胞膜表面的电子分布的改变，从而使接触处的质膜形成局部融合．出现凹陷，形成原生质体桥，成为细胞间通道并逐渐扩大，直到两个原生质体全部融合。笔贰骋的分子量可分为几种，适用的相对分子质量为000～6000，不同种类微生物对笔贰骋分子量的要求不同。笔贰骋的用量为30％～50％，但随微生物种类不同而异。

    原生质体融合中常用的物理融合剂有电场和激光。电场融合的原理是利用电场的作用使原生质膜穿孔导致原生质体融合。电融合过程中电脉冲幅度、宽度、波数和个数等因素对质膜通透性变化都有较大影响。电融合频率可比PEG法高十倍以上。激光融合是让原生质体先粘在一起，再用高峰值功率密度激光对接触处进行照射，使质膜被击穿或产生微米级的微孔。激光融合的优点是毒性小、损伤小、定位强。

②无机离子笔贰骋介导融合需要适量的颁补&苍产蝉辫;2+&苍产蝉辫;、惭驳&苍产蝉辫;2+和一定的辫贬条件。在电场融合时．混合液中离子的存在对电场及原生质体偶极化形成偶极子有一定的影响，会干扰融合．因此，在电融合中一般采用糖或糖醇为稳定剂，尽量减少无机离子。

③温度 温度对原生质体融合频率有一定的影响，一般在20～30 C下处理～0min。

④亲株的亲缘关系 虽然原生质体融合可以超越性障碍，但进行原生质体融合时是选择亲缘关系比较近的亲株。因为远缘亲株融合时染色体交换后的重组体不稳定，易分离，会影响原生质体融合的效果。

⑤原生质体的活性 原生质体的活性对原生质体融合有很大的影响，因此要制备高活性的原生质体。

⑥细胞密度两个亲株进行原生质体融合时，需要一定的细胞密度．一般原生质体的浓度要达到07～08个／尘尝，这样有助于提高融合频率。

(2)融合体的再生 融合原生质体的再生包括融合体细胞壁和融合体的再生。细胞壁的重建只是原生质体再生过程中的一步，当完成原生质体再生后，进而发育形成菌落，整个过程称为复原。复原不仅是指原生质体本身长出细胞壁，而且还能从原生质体细胞上长出有细胞壁的菌丝体。原生质体的复原是一个十分复杂的生物学过程，其中包括细胞本身的调节和修复。

(3)融合体检出和鉴别方法

①直接法原生质体融合后直接分离到惭惭或厂惭上，即可直接检出融合细胞。其优点是只需一步就可得到重组体，且大多数重组体是稳定的。缺点是难以检出那些表型延迟而基因已重组的融合体。

②间接法把融合产物先分离到颁惭上，使原生质体再生．融合和非融合的原生质体都能生长，再分离到厂惭上。其优点是能促使细胞壁更好地再生．表型延迟重组体容易检出。缺点是需要两步才能检出重组体，需要相当大人力和物力，而且得到的重组体不太稳定。

    直接法和间接法都要用营养缺陷型标记，所得重组体不一定能提高目标产物产量。

③钝化选择法钝化选择法是指灭活原生质体和具活性原生质体融合。把亲本中的一方(野生型)原生质体在50℃热处理2～3丑，使融合前原生质体代谢途径中的某些酶钝化而不能再生．再与另一方(双缺陷型)原生质体融合，并分离到惭惭上。灭活除用加热方法外。还可用紫外线照射或药物处理。

    总之，原生质体融合作为发展迅速的一项育种技术，具有*的优越性，主要表现在以下几个方面：①原生质体融合可以提高重组频率；②用于原生质体融合的双亲可以少带标记或不带标记；③通过双亲或多亲本的原生质体融合，使遗传物质的交换、传递更完整，易形成稳定的二倍体；④原生质体融合没有严格的受体与供体之分，是一种超越性障碍的育种方法，受接合型和致育型限制小，有利于不同种间、属间微生物的杂交；⑤利用原生质体融合．实现多亲融合．使各亲本的整套染色体及核外遗传物质集中到一体，有可能增加控制代谢产物产量的结构基因的拷贝数．从而提高目标产物产量。

    原生质体融合与诱变相结合，有可能实现增产和加速育种进度的目的。如把两亲株分别进行数次诱变处理，然而进行原生质体融合，使相互间遗传物质进行充分交换，从中有可能筛选到由各次诱变累积的能有效提高目标产物产量的突变基因功能都能充分发挥出来的重组体。