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细胞培养基制备原材料需要及裂解液的制备

    细胞培养基的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。细胞培养基的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。

　　微生物、植物和动物都可做为制备细胞培养基的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生，在微生物的对数生，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如细胞培养基、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。

裂解液的制备步骤：

    、将长满细胞的培养基瓶放置在冰上，用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的PBS在培养瓶中充分洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养基，倒掉PBS ，重复以上操作2-3遍。在zui后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。

　　2、向培养瓶中加入冷的RIPA 裂解缓冲液(每75cm2 培养瓶加ml). 然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细胞有多瓶，则将*瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮(由于处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取)。

　　3、吸出刮好的细胞裂解液置于4ml 离心管中（置于冰上），然后重复步骤2以刮取剩下的细胞。

　　4、尽可能将多的细胞培养基裂解液收集到4尘濒的离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应离心0000谤辫尘,0分钟，留取上清。

　　5、取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度（用Biorad Bradford 八戒影院或紫外分光光度计，在A280测定），分装保存在-70℃。